Методи вирощування і визначення бактеріальних вірусів
Відео: Здоров`я
Зміст
Бактеріофаги широко поширені в навколишньому середовищі - водоймах, грунті. Фаги кишкових бактерій (кишкової палички, шигел, сальмонел) можуть битьвиделени з стічних вод і випорожнень. Фаги стафілококковобнаружівают вслізі з носоглотки, на шкірі і в ранової виділеннями, фаги клостридий, що викликають анаеробну ранову інфекцію, - в ранової виділеннями, грунті. Налічіефага в середовищі вказує на присутність чутливих до нього бактерій.
Існують вірулентні і помірні фаги. Вірулентні фагівизиваютпродуктівную інфекцію, яка закінчується утворенням нових фагових частинок ілізісом бактеріальних клітин. Помірні фагівизивают інтегратівнуюінфекцію, що не приводить до лізису заражених ними клітин. ДНК цих фаговвключается в хромосому бактерій і передається при їх розподілі неограніченномучіслу нащадків. Такий тип взаємодії фага з клітиною називаютлізогеніей, а бактерії, що несуть у своїй хромосомі фагів ДНК (профаг), являютсялізогеннимі. Під дією різних факторів в клітинах лізогенних бактерійможет відбуватися індукція профага - вищепленію його ДНК з хромосоми бактерії ірозвиток продуктивної інфекції. Лізогенія фаги широко поширені вприроді.
Репродукція вирулентного фага в клітинах бульонной бактеріальнойкультури супроводжується лізисом бактерій і просвітленням середовища. На газонечувствітельних бактерій, вирощених на щільному живильному середовищі в чашці Петрі, фаги утворюють зони осередкового або суцільного лізису, що залежить від їх концентраціі.Зони осередкового лізису отримали назву негативних колоній фага, ілістерільних плям - бляшок (рис. 1).
Рис.1. Негативні колонії (стерильні плями) бактеріофагів: а - плями фага Т2- б - плями фага T1
Вони мають морфологію, характерну для певних фагів, і образуютсяіз однієї фагової частки при її впровадженні та подальшої репродукції вбактеріальних клітинах. Кожна інфікована фагом бактерія лизируется іосвобождает потомство фага, що складається з сотень нових фагових частинок. Вони внедряютсяв інтактні клітини, і весь цикл повторюється. В результаті лізису клітин насплошном бактеріальному газоні з`являються негативні колонії фага.
Для отримання "чистої" лінії фага (вільної від прімесідругіх фагів) проводять послідовні пасажі морфологічно однотіпнихнегатівних колоній на газоні одного і того ж бактеріального штаму.
Більшість фагів характеризується відоспеціфічностьюв отношеніібактерій. Однак існують фаги, які можуть вражати тільки отдельниеваріанти одного і того ж виду бактерій. Їх використовують для определеніяфаготіпов (фаговаров) всередині даного виду. Разом з тим є фаги, лизирующие споріднені види бактерій.
У практичній роботі фаги застосовують для:
1) фаготипирования бактерій, тобто визначення фаготип по лізісуштаммов бактерій одного і того ж виду типоспецифічними фагами, що важливо длямаркіровкі досліджуваних бактерій при епідеміологічному аналізі захворювань;
2) фагоідентіфікаціі бактеріальних культур з метою встановлення іхвідовой приналежності;
3) фагодіагностікі, що полягає у виділенні фага з організмабольного (наприклад, з випорожнень), що побічно свідчить про наявність вматеріале відповідних бактерій;
4) фагопрофілактика - попередження деяких захворювань (наприклад, дизентерії) серед осіб, які перебувають в епідемічному осередку;
5) фаготерапіі - лікування деяких інфекційних захворювань, викликаних, наприклад, шигеллами, протеєм, стафілококом. [3]
Виділення фага ізоб`ектов навколишнього середовища
Для отримання вирулентного фага готують фільтрат, пропускаючи ісходнийматеріал (вода, суспензія фекалій та ін.) Через бактеріальні фільтри. Фільтратвместе з відповідною бактеріальною культурою засівають в бульйон і інкубіруютпрі 37 ° С протягом 18 - 24 год. Після лізису культури залишилися бактеріальниеклеткі видаляють центрифугуванням або фільтрацією через бактеріальний фільтр.Налічіе фага в фільтраті визначають якісними і колічественниміметодамі. [3]
Якісний метод определеніяфагов E.coli
Чашку Петрі спітательним агаром засівають добової бульонной культуройкішечной палички газоном і підсушують при 37 ° С протягом 10-15 хв. Потім на поверхню газону наносять краплю фага і нахиляють так, щоб крапля скла кпротівоположному краю. Після добової інкубації в термостаті переглядають чашку, відзначаючи наявність зони лізису за місцем стікання краплі фага. [3]
Кількісний метод - определеніетітра фага за методом Граціа
Дляпостановкі досвіду попередньо:
а) разліваютпітательний агар в чашки Петрі, підсушують в термостаті;
Відео: Комп`ютерна діагностика організму Імедіс
б) пріготовленнийполужідкій (0,7%) поживний агар, розлитий по 3 - 4 мл в пробірки, розтоплюють на водяній бані. Роблять 10-кратні розведення досліджуваного фага (10-2- 10-7 в залежності від передбачуваного титру) в ізотоніческомрастворе хлориду натрію. Потім 0,5 мл з останнього розведення фага (10-7) Змішують з таким же об`ємом добової бульонной культури чутливих до фагубактерій і виливають в пробірку з напіврідким агаром, охолодженим до 45 0С.Смесь швидко виливають на поверхню агару в чашці Петрі, де вона застигає у вигляді тонкого шару.
Так жеготовят суміш з наступного розведення фага (10-6) З бактеріями іполужідкім агаром і виливають на поверхню агару в іншій чашці, потім - ізразведенія 10-5. Після застигання другого шару агару чашкіінкубіруют при 370 С, потім підраховують число негативних колонійфага. Число цих колоній відповідає кількості фагових частинок в засеяннойсмесі. Виходячи з нього, можна обчислити кількість пятнообразующіх одиниць в1 мл вихідної суспензії фага.Ета величина, що характеризує концентрацію фага, називається його титром (табл.1).
| Номер досліджуваної проби | число "стерильних" пятенфага отриманих при посівах проб вразведеніях | Число фагових частинок в 1 мл | ||
| 10-5 | 10-6 | 10-7 | ||
| 1 | 370 | 24 | 3 | 7,3x107 |
| 2 | 463 | 50 | 6 | 1,0x108 |
| 3 | 37 | 4 | 0 | 7,7x106 |
Таблиця 1. Результати титрування фага але методу Граціа (форма протоколу)
Відео: Як визначити кислотність ґрунту народні способи
Визначення спектру літичної дії фага
Чашку з поживним агаром ділять на квадрати по числу іспитуемихбактеріальних культур. На кожен квадрат петлею наносять краплю соответствующейбульонной культури і розподіляють її по агару в межах даного квадрата.Затем на кожен засіяний квадрат петлею або пастерівської піпеткою наносять поодному краплі випробуваного фага. Після добової інкубації в термостатепросматрівают чашку, відзначаючи ті квадрати, де є суцільний лізис бактерійілі так звані стерильні плями на бактеріальному газоні. Колічестворазлічних бактеріальних культур, які лізуються випробуваним фагом, визначає широту спектра його літичної дії.
фаготіпірованіе бактерій
Випробувану добову бульонную культуру бактерій засівають на поверхностьпітательного агару в чашці Петрі, злегка підсушують в термостаті, потім делятна квадрати, на які пастерівської піпеткою наносять по одній краплі разлічнихтіпоспеціфіческіх фагів. Після добової інкубації відзначають на чашці теквадрати, в яких є суцільний лізис бактерій. Фаготип бактеріальнойкультури визначається тим типом фага, який викликає її лізис.
визначення лизогении
Протягом багатьохроків спосіб звільнення фагових частинок з лізогенних бактеріальних клітин билпредметом спору. Згідно з однією поширеною теорії фаг виділяється растущейбактеріальной культурою подібно позаклітинного бактеріального ферменту (Нортроп, 1939). Відповідно до іншої теорії при розпаді бактеріальної клітини освобождаетсянекоторое число фагів частинок майже таким же шляхом, як це спостерігалося пріізученіі вірулентних фагів (Бернет, 1929). Це питання було, нарешті, разрешенЛьвовим і Гутман (1950), які за допомогою мікроманіпулятора показали, чтофаговие частки не виділяються розмножуються лізогеннимп бактеріями, апоявляются групами при розпаді окремих бактеріальних клітин.
Відео: Приготування мазка бактеріальної культури
Досліджувану суточнуюбульонную культуру центрифугують для відділення фага від бактерій. У тому випадку, якщо бактерії спонтанно продукують фаг, останній буде міститися внадосадочной рідини. Для виявлення фага надосадову рідину засівають нагазон індикаторного (чутливої) бактеріальної культури, на якому через 1 доба інкубації при 37 0З утворюються осередки лізису"стерильні" плями. При негативному результаті досвіду ісследуемуюбактеріальную культуру попередньо піддають УФ - опромінення з цельюіндукціі міститься в ній профага. Потім роблять так само, як і впредидущем досвіді.
